文|編輯唐文筆飛揚|唐文筆飛揚

GO和r-GO作為二維納米材料，具有獨特的化學和物理特性，使其在生物醫學、電子元器件、儲能等領域具有廣闊的應用潛力。

但隨著其應用范圍的擴大，人們對其潛在的毒性作用產生了懷疑。 因此，全面的體外藥理評價是保證GO和r-GO安全應用的關鍵。

石墨烯基納米材料（GO 和 rGO）的細胞毒性評估

GO 和 r-GO 的細胞毒性最初是使用改良的乳酸酯酶 (LDH) 測定法進行評估的，該測定法基于細胞內 LDH 水平的量化而非 LDH 釋放。

LDH 的釋放可以揭示細胞膜的損傷，這是壞死的跡象，而改良的 LDH (m-LDH) 檢測僅提供樣品中活細胞數量的信息，不能作為壞死的指標。

然而，這些變化允許在分析之前去除多余的納米顆粒，從而降低干擾碳基納米材料的風險。

因此，m-LDH 測定被認為是迄今為止評估此類材料細胞毒性的最可靠方法。 GO和r-GO的評價結果??表明，毒性與時間和含量有關，與細胞類型和數學物理有關。 功能相關。

更短的暴露時間（3 小時）不會對材料或細胞類型造成明顯的毒性，但是，從 24 小時開始，可以觀察到材料之間的差異。

對于MRC-5細胞，細胞存活率隨著時間的推移和GO含量的降低而增加，最高含量條件下的細胞存活率分別為12.9±35%和5.2±27%。

細胞暴露于 GO 含量高達 1/ml 24 小時導致所有處理具有相似的功效（大約 70-60% 的細胞活力）。

但48小時后，不僅是最低的兩個水平，其他水平的細胞活力均低于LD50。

相比之下，暴露于 r-GO 不會顯著影響細胞活力，其在所有處理和時間點都保持在 80% 的毒性閾值附近。

對于 A549 細胞，GO 和 r-GO 顯示出非常相似的細胞毒性特征，并且對于這兩種材料，細胞毒性隨著含量和時間的減少而逐漸降低。

雖然r-GO的毒性與MRC-5的結果幾乎一致，但與健康細胞相比，GO對癌細胞的作用較弱。

事實上，24 和 48 小時后，A549 細胞在 1/ml 時的存活率是 MRC-5 細胞的兩倍。

最常用的細胞毒性測定有一些局限性，因此尋求替代方法來確認細胞毒性數據。

在用于研究細胞存活的所有測量中，基于發光的分析是唯一沒有報告對碳基材料產生干擾的分析。

然而，關于金屬納米粒子干擾的報告表明，使用這些檢測方法可能存在問題，干擾光并不是唯一需要考慮的原因。

事實上，由于碳基材料與非胺甲唑藍晶體的相互作用，MTT 等代謝檢測可能會導致假陽性（廣譜）結果。

考慮到所有這些激勵措施，研究了一種新的發光測定模式 - MT - 以評估其對石墨烯納米材料研究的適用性。

這些特定的細胞存活測定測量活細胞的還原潛力，因此不允許消除納米材料，使該測定非常適合干擾研究。

在這種測定形式中，信號是通過將還原的 MT 底物從細胞擴散到周圍介質中產生的，底物與熒光素酶結合，產生的發光信號與活細胞的數量相關。

在最初的實驗中，只使用了 GO，因為它比 r-GO 具有更好的分散性。

盡管考慮了終點、敏感性和毒性機制的差異，但暴露 3 小時后獲得的細胞存活結果已經表明可能存在干擾，因為這些較短的暴露時間與 GO 的明顯毒性無關。

相反，-MT 細胞存活結果顯示，盡管暴露于低水平的 GO (31.25ug/ml)，但細胞存活率增加了 50%。

值得注意的是，在使用改良的 LDH 測定法評估細胞毒性時，沒有觀察到這些毒性水平，盡管在更高的水平和 48 小時的處理時間。

眾所周知，基于代謝的測定可能會低估物質對細胞代謝的影響而不影響細胞活力，因為此類測定將代謝活動描述為細胞活力的間接指標。

然而，與預期高的 m-LDH 分析數據相比，-MT 分析觀察到的 GO 對 A549 細胞的顯著細胞毒性在 31.25 至 125 ug/ml 范圍內的所有時間點均超過了-MT 分析靈敏度。

為了闡明與 m-LDH 測定數據的差異，進行了另一項實驗，其中將細胞與測定試劑一起孵育，并在 24 小時后測量熒光硬度。

確定基線后，向孔中加入不同含量的GO，立即檢測熒光硬度。 結果表明，加入GO后熒光硬度顯著降低。 當含量為15.6和/ml時，平均信號分別降低。 25% 和 95%。

綜合所有這些結果，可以推斷 GO 會干擾基于熒光的測定。 雖然沒有報道，但這在某種程度上是意料之中的。 由于碳納米材料會干擾熒光，因此這是一個密切的相關性。 現象。

據報道，GO 與測定中的試劑之間的相互作用不可忽略，很可能需要修改熒光測定，引入額外的步驟來消除納米顆粒，類似于 LDH 測定所需的步驟。

石墨烯納米材料的細胞相互作用

在確定了石墨烯衍生物在肺細胞中可能產生的細胞毒性作用后，我們詢問細胞毒性是由于內吞作用還是與質膜相互作用。

一些研究表明，石墨烯納米顆粒的摻入是其觀察到的細胞毒性的原因，而另一些研究表明，石墨烯摻入細胞可以提供治療性抗生素而不會對細胞造成損害。

納米粒子進入細胞需要不同的能量依賴性內吞過程。 內吞途徑有多種類型，包括吞噬作用，它可以主動將大顆粒（>）內吞到吞噬細胞中。

據報道，內吞作用根據納米粒子的大小分為多種機制，即微吞噬作用（

非吞噬細胞如 A549 和 MRC-5 也可以攝取小顆粒。 研究中石墨烯衍生物的平均粒徑主要大于。 預計它們在 MRC-5 和 A549 細胞中的內吞作用將通過細胞內吞咽機制進行。

一些納米粒子有可能通過質膜被動擴散進入細胞，例如，據報道碳納米管通過穿透質膜進入細胞。

熒光染色通常用于研究納米粒子如何被細胞吸收，然而，信號淬滅使這些方法不適用于石墨烯納米材料。

Al-He 提出了一種替代方法，該方法基于流式細胞術對光散射變化的定性評估。

具體來說，這種方法基于碳基納米材料與細胞的結合，導致粒徑減小，進而轉化為側向散射分布的變化。

側向散射模態已成功用于研究碳納米管、氧化鋅、二硅氧烷和銀納米粒子的攝取，雖然難以區分納米粒子的細胞吸附和細胞內吞，但有望進一步改進。 提供有關石墨烯納米材料與細胞相互作用的有用信息。

在本實驗中，細胞暴露于 /ml 的最高濃度，由于石墨烯衍生物在較高濃度下表現出的高細胞毒性，細胞計數可能較低。

實驗已知，側向散射分布沒有變化表明納米材料與 MRC-5 和 A549 細胞之間的相互作用可以忽略不計。

這在一定程度上挑戰了細胞毒性數據，特別是在 MRC-5 細胞的情況下，在 /ml 的 GO 處理 48 小時后觀察到的低細胞活力表明細胞和納米材料之間存在某種關系。 相互作用。

GO 和 r-GO 細胞毒性的機制評估

細胞暴露于細胞毒性物質會導致不同類型的細胞死亡，其中一個例子是被稱為壞死的無意細胞死亡。

壞死過程表現為快速的細胞疼痛和膜完整性的喪失，導致細胞內物質釋放到周圍環境中。

壞死性細胞死亡不是細胞死亡的唯一形式，細胞也可能經歷自噬，這是一種高度調節的細胞自殺過程。

自噬的標志包括細胞質收縮、細胞膜破裂、細胞核凝縮和明確無誤的破裂。 除了自噬和壞死，端粒是細胞死亡的另一種機制。

端粒是一種循環系統，可以分解異常的蛋白質團塊、細胞質成分和受損的細胞器，然而，不受限制的細胞凋亡可能導致非自噬性細胞死亡。

據報道，端粒功能的破壞會導致細胞損傷并導致細胞死亡，這被認為是納米材料毒性的潛在機制之一。

納米顆粒毒性的機制已得到廣泛研究，據報道，不同類型的納米材料可以通過在許多生物系統中形成活性氧 (ROS) 來誘導毒性。

ROS 的過量形成會導致氧化應激，這種情況會導致不受控制的細胞信號傳導、細胞運動的變化、遺傳毒性、致癌作用、自噬和自噬，以及不同的毒性終點。

推理：

對于 GO，與細胞的化學相互作用實際上比 r-GO 更明顯，這反映在對兩種細胞系的細胞信號蛋白的明顯影響上。

納米顆?？梢耘c細胞膜受體相互作用，從而調節信號轉導通路。 因此，GO納米片與細胞膜受體的結合可能會引起信號干擾。

GO 易位到細胞中可能是觀察到的細胞紊亂的觸發因素，但需要進一步的工作來否認這一點。

提出GO的形狀（像條狀結構）可能會阻塞A549細胞表面的通道，從而干擾物質交換。

該研究還表明，GO進入A549細胞的能力較差。 因此，細胞膜對物質交換的阻斷可能是GO的間接作用，導致不同細胞信號通路失調。

關于 GO 納米片的間接作用的另一種可能性是它們從培養基中吸收營養，引起氧化應激和細胞饑餓，從而誘導細胞凋亡，這是許多研究人員報道的一種現象。

總之，GO 而不是 r-GO 可以誘導肺細胞系中細胞信號通路的失調，這些能力可能具有臨床意義，也可能闡明與 GO 藥理作用相關的機制。

參考：

1. 石墨烯對動物生理毒性作用的研究進展。 翁以能； 江楠； 李嘉欣； 應志寧； 杜少霆。 應用生態學雜志, 2020

2. 石墨烯材料與蛋白質的相互作用。 王小娟； 劉真真； 陳琪; 王小強； 黃芳。 物理學進展, 2019

3、氧化石墨烯在生物醫藥領域的應用。 杜夏夏； 舒剛; 陳宗彥。 功能材料, 2018

4. 石墨烯的制備、功能化及應用。 宗魯彥； 常旭; 吳慧霞； 楊世平。 南京師范大學學報(自然科學版), 2016

5. 石墨烯和氧化石墨烯對細胞脂質膜損傷作用的研究。 屠宇松； 方海平。 中國科學：數學，熱天文學，2016